生物分子凝聚体通常由液液相分离形成，并可通过内部区室化实现不同组分和反应过程的空间组织。由短肽形成的核壳多相凝聚体具有结构简单、序列可设计和环境响应性强等特点，是研究凝聚体组织规律、构建人工细胞器及开发智能生物材料的重要模型体系。已有研究表明，色氨酸残基对于部分极短肽核壳凝聚体的形成至关重要，其组装取决于肽–水相互作用和芳香侧链堆积之间的平衡。然而，现有体系仍面临两方面挑战：一是缺少能够在单分子位点上精细调节核壳结构的分子策略；二是传统荧光成像通常依赖外源染料，而染料在不同相区中的分配差异可能干扰对真实内部结构的判断。因此，发展兼具组装调控能力和本征光谱响应的分子单元，对于多相凝聚体的精准设计与无标记表征具有重要意义。

近日，william威廉中文官网盖锋课题组将兼具本征荧光与氰基红外响应的非天然氨基酸4-氰基色氨酸（4CN-Trp）引入液液相分离短肽，仅在单个位点将色氨酸替换为4CN-Trp，即实现了多相短肽凝聚体核壳结构的反转，并利用4CN-Trp自身的荧光和红外信号对凝聚体内部微环境进行无标记表征。这项工作表明，4CN-Trp不仅能够作为本征光谱探针探测凝聚体微环境，还可作为结构调控单元重塑其内部组织，为多相短肽凝聚体的精准设计与无标记表征提供了新的分子策略。该成果以“Tuning and Characterizing the Structure of Peptide Core-Shell Multiphasic Condensates by the Blue Fluorescent Amino Acid 4-Cyanotryptophan”为题于2026年8月4日在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）上在线发表。

基于“sticker–spacer”设计框架，作者将天然色氨酸（W）与4-氰基色氨酸（W_CN）分别置于肽链两端，并以甘氨酸G作为间隔残基，设计并合成了WW_CN与WG_nW_CN（n = 1–3）系列短肽，系统考察了芳香族残基的细微化学修饰如何调控液液相分离及多相凝聚体的内部结构（图1A）。研究发现，当溶液pH由6.5升至约7.5时，WG_nW_CN可发生液液相分离并形成球形液滴（图1B–D）；而WW_CN二肽在相同条件下仅形成不稳定的无定形聚集体，无法像天然WW二肽那样组装成稳定的核壳结构。此外，与天然WG₃W形成均质液滴不同，WG₃W_CN相分离后依然保留了核壳结构。pH–浓度相图（图1E–G）进一步显示，甘氨酸间隔越少，相分离所需临界浓度越低；肽浓度越高，触发相分离所需的临界pH也相应降低，表明该替换虽未改变短肽响应pH发生相分离的能力，却显著改变了其组装的热力学特征。

图1. 4CN-Trp修饰短肽的分子结构（A）、明场图像（B–D）及pH–浓度相图（E–G）。

作者进一步结合双光子激发荧光成像、荧光漂白恢复（FRAP）、荧光寿命成像（FLIM）、冷冻扫描电镜与红外光谱等，对凝聚体的形貌特征、分子流动性与微环境性质进行了系统表征。荧光强度成像显示，凝聚体由明亮的环形外壳与较暗的内核构成（图2A–C）。FRAP结果（图2D–F）显示，漂白内核区域后，荧光可在数分钟内恢复约80%，表明内核具有明显的分子扩散与交换能力。FLIM结果（图2G–I）显示内核荧光寿命较长，外壳荧光寿命较短，表明内核水合程度更高、分子受限程度更低，而外壳则呈现更强的自淬灭，反映外壳中4CN-Trp发色团分子堆积更致密、更刚性。这种形貌与生物囊泡相似——流动的含水腔室被结构化程度更高的边界所区室化。

图2. 多相短肽凝聚体的荧光强度成像（A–C）、FRAP分析（D–F）和荧光寿命成像（G–I）。

冷冻断裂扫描电子显微镜进一步揭示了凝聚体的截面形貌（图3）：WG₁W_CN凝聚体外层呈更明亮、平滑的衬度，指示更致密的分子堆积与更高的局部电子密度；内部则相对多孔、电子密度较低，提示内核为疏松堆积或部分水合的相。冷冻扫描电镜还捕捉到两个凝聚体融合的中间状态，表明即使外壳呈类固态特征，凝聚体界面仍保留一定的流动性。红外光谱表征进一步表明，发生相分离后4CN-Trp的C≡N基团伸缩振动峰发生显著红移，证明凝聚体中C≡N所处的局部静电与水合环境发生改变。

图3. 基于冷冻扫描电镜表征的WG₁W_CN凝聚体截面形貌（A）及融合过程（B）。

该研究成果表明，单个位点的非天然氨基酸替换即可显著改变极短肽的相分离边界与内部组织，使相应天然色氨酸短肽形成的“类固态内核–液态外壳”结构反转为“液态内核–类固态外壳”。与此同时，4CN-Trp自身的荧光和氰基红外响应能够分别提供空间成像和局部微环境信息，在同一体系中兼具“结构调控单元”与“本征光谱探针”的双重功能。氰基取代可能通过改变吲哚侧链的电子性质、局部水合状态及芳香堆积方式，重新调节肽–水与肽–肽相互作用之间的平衡，进而驱动核壳结构反转。该工作为多相短肽凝聚体的分子设计、无标记成像和微环境解析提供了新的分子工具，也为人工细胞器和刺激响应软物质材料的构筑提供了新的研究思路。

william威廉中文官网博士研究生李金为该文章的第一作者，盖锋教授为通讯作者。博士研究生徐若竹、博士后庄勃、本科生周钰翔也共同参与了该项研究工作。该研究得到了北京分子科学国家研究中心和国家自然科学基金委员会的支持与资助。

论文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c12051

排版：牟凯
审核：牛林，刘志博