拓扑蛋白质因其独特的结构特征和功能优势正逐渐引起研究者的关注。在天然蛋白质结构中已发现环状、纽结、套索和链环等不同的拓扑类别，它们所展现出的稳定性优势启发着研究者将拓扑作为蛋白质工程的全新维度。利用以p53二聚结构域为代表的蛋白质缠结基元和可基因编码的蛋白质化学偶联工具，研究者已成功实现包括轮烷、套索、索烃和纽结等不同拓扑蛋白质的人工设计与合成。然而，目前人工蛋白质的拓扑复杂性和结构多样性仍然有限，例如天然存在的所罗门链环（Solomon link）和5₂结（three-twist knot）等复杂拓扑结构，尚未有成功的人工构建报道。为了突破这一瓶颈，北京大学张文彬课题组近期通过对称组装正交缠结基元，实现了蛋白质所罗门链环和5₂结这两种拓扑异构体的计算设计与胞内合成。

研究者首先开发了名为CnCombo的计算模拟平台，通过将两个C₂对称的缠结基元（X和K）以特定融合模式进行组合，在对称性约束下系统采样旋转角度和翻转状态等几何参数，成功预测了能够导向所罗门链环和5₂结形成的构象。基于模拟结果，研究者设计了相应的融合蛋白构建XK和KX-KX，并利用分离型内含肽介导蛋白质主链在细胞内的原位环化，以合成目标蛋白质所罗门链环和5₂结。他们也构建并合成了相应的拓扑结构更为简单的对照样品，分别包括Hopf链环、3₁结以及简单的线型构建（图1）。

图1. 融合蛋白质构建和合成路线示意图。

在拓扑确证方面，使用TEV蛋白酶对目标拓扑蛋白质进行可控的水解切割。所罗门链环和Hopf链环经部分酶切后产生环状与线型单体的混合物，完全酶切后全部转化为线型产物；5₂结与三叶草结对照也呈现出预期的转化为全长线型链的酶切模式。这些特征酶切图谱与结构紧凑性差异共同为拓扑归属提供了有力证据（图2A）。尤为重要的是，研究团队基于5₂结的串联融合构建，采用胞外偶联策略进行合成，成功解析了其晶体结构（PDB ID: 21GI），清楚表征了蛋白质主链的5₂结拓扑（图2B），其与CnCombo平台的设计模型高度吻合，验证了该计算平台在复杂蛋白质拓扑设计中的预测能力。

图2. 蛋白质所罗门链环和5₂结的拓扑结构表征。

在性质表征方面，DSC和化学变性实验表明，所罗门链环和5₂结相对于拓扑复杂度较低的对照（如Hopf链环、三叶草结及线型）均表现出更高的稳定性（图3）。具体而言，所罗门链环的X结构域和K结构域的熔解温度（Tm）分别比线型对照提高了16 °C和19 °C；5₂结的两个结构域的Tm则分别提高了15 °C和9 °C。化学变性中点浓度的测定也显示，机械互锁拓扑本身是稳定化效应的主要来源。这些结果表明，具有高阶化学拓扑的蛋白质在稳定性方面具有显著优势。

图3. 蛋白质所罗门链环和5₂结的稳定性表征。

综上所述，该研究建立了通过组合对称正交缠结基元来构建复杂蛋白质拓扑的模块化策略，为实现丰富多样的机械互锁蛋白质提供了理性且可拓展的途径。这一策略有望推广至更复杂的拓扑结构，如蛋白质锁子甲纳米笼和编织框架等。该工作不仅丰富了人工拓扑蛋白质的结构多样性，也为下一代生物材料和蛋白质药物的开发提供了新的设计思路。

该研究成果近期发表于Proc. Natl. Acad. Sci. USA，william威廉中文官网许连杰博士和北京大学生命科学学院宋晓慧博士为该论文的共同第一作者，北京大学生命科学学院徐华博士也为本工作做出了贡献，william威廉中文官网吴文豪博士、北京大学生命科学学院苏晓东教授和william威廉中文官网张文彬教授为论文共同通讯作者。该工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心、中国博士后科学基金等项目的资助。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2537891123

排版：高杨

审核：牛林，刘志博